中国农业大学赵广华/张拓《ACS Nano》：二聚体构建体定向自组装成网状蛋白质折纸以构建水凝胶
工程蛋白质构建自组装不仅对于理解复杂的生命系统，而且对于制造具有未开发功能的先进材料有着至关重要的意义。然而，由于蛋白质表面固有的化学异质性和结构复杂性，以各向异性方式设计复杂的蛋白质装配体仍然具有挑战性。
中国农业大学赵广华教授、张拓副教授团队描述了一种通过在单个蛋白质构建体的不同位置上设计双重非共价相互作用来制造具有网络状结构的蛋白质折纸的自组装方法。以二聚体蛋白为构建体，通过在关键蛋白界面设计金属配位构建一维蛋白丝。随后，网络上层结构是通过第二个设计的π-π堆叠相互作用在分支点连接处交联一维蛋白质细丝而构建的。值得注意的是，随着蛋白质浓度的增加，形成的蛋白质网络转化为具有可逆、可注射和自愈特性的水凝胶，具有促进骨再生的能力。这种策略可用于制造其他具有未开发功能的蛋白质材料。该工作以题为“Directed Self-Assembly of Dimeric Building Blocks into Networklike Protein Origami to Construct Hydrogels”发表在《ACS Nano》上。
【金属介导的一维蛋白丝的设计】
作者使用Thermotoga maritima铁蛋白变体(Tm-ΔE)作为天然蛋白质构建体来构建3D蛋白质网络。野生型Thermotoga maritima铁蛋白在其亚基的C末端缺失一个短螺旋后，通过基因修饰很容易制备Tm-ΔE。作者将单个残基Gly40突变为Glu，纯化所得变体Tm-ΔEG40E。TEM结果显示，在没有Zn2+的情况下不能形成5 nm均匀直径的显着单分散细丝，证明了Zn2+在蛋白质细丝中的作用。此外，还有其他三个锌离子与位点B处的蛋白质-蛋白质界面沿线排列的酸性残基结合，消除了静电排斥并进一步加强了设计的界面。
图1：网络状蛋白质折纸的示意图
图2：通过Zn2+配位调节的蛋白质丝的表征
【蛋白质分支点连接的设计】
作者计划以60°的旋转角放置两个相邻的构建体来构建π-π相互作用作为Tm-ΔE二聚体之间的化学键。Ser111位于二聚体外表面的边缘，是构建基于组氨酸的π-π堆叠相互作用的理想位置，因此制作了第二个变体，命名为Tm-ΔES111H。该相互作用驱动蛋白质二聚体形成右手螺旋超结构。此外，其他静电和疏水相互作用使Tm-ΔES111H二聚体能够自组装成具有规则三角形孔的大型3D晶体阵列。
图3：晶体结构和分支点连接的排列
【网络状蛋白质折纸结构的构建】
为了将设计的分支点链接附加到一维蛋白丝上，生成了一个名为Tm-ΔEG40E/S111H的第二代变体，在功能上是Tm-ΔEG40E和Tm-ΔES111H的组合。在低蛋白浓度下，Tm-ΔEG40E/S111H分子开始自组装成网络结构，其中一维蛋白丝交联，主要形成60°角的Y形结构，证实了对分支点连接的设计。在2小时后进一步交联成蛋白质网络，并最终在孵育过夜时组装成大块蛋白质装配体。
图4：蛋白质网络结构的表征
【自组装法制备蛋白质水凝胶】
随着Tm-ΔEG40E/S111H的浓度增加到25.0 mg/mL，形成了Zn2+导向的蛋白质自组装水凝胶。制造的蛋白质水凝胶是半透明且均匀的，没有可见的侵蚀。用10.0 mM的EDTA处理后，由于Zn2+的去除，水凝胶完全溶解；而通过透析去除EDTA，然后与Zn2+混合后，水凝胶再次产生，表明完全可逆的过程。阶跃应变测试、动态频率/时间扫描等所有流变学结果都显示了制造的蛋白质水凝胶的稳定、可注射和自愈特性。
图5：设计的天然蛋白质水凝胶的表征
考虑到锌作为人体必需的营养素，可以作为促进骨再生的治疗剂，构建了一个临界尺寸的大鼠胫骨缺损模型，以直接确定水凝胶对骨修复和再生的能力。将设计好的蛋白质水凝胶、胶原水凝胶和等体积的8 mM锌溶液分别局部注射到缺损处。植入4周后，显微CT图像显示植入蛋白质水凝胶和胶原水凝胶的缺陷都几乎愈合，骨形成能力显着增强，表明这两种不同类型的水凝胶表现出相似的骨再生活性。
图6：体内骨再生能力评估
【小结】
在这项工作中，作者报告了一种用于设计各向异性蛋白质网络的自组装策略，该策略基于在单个蛋白质构建体的不同位置上构建的两种非共价相互作用的组合。这两种相互作用的原子级准确性通过它们的晶体结构得到证实，这为设计的自组装可编程蛋白质折纸结构的结构特征提供了清晰的理解，也为制造其他基于蛋白质的材料提供了机会。在相对较高的蛋白质浓度下，设计的网络状蛋白质折纸组件进一步组装成蛋白质水凝胶，具有可逆性和可注射性，有助于它们在医学、食品和营养领域的应用。
——本文转自公众号“高分子科技前沿”
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